Anthelmintic activity of nanoencapsulated carvacryl acetate against gastrointestinal nematodes of sheep and its toxicity in rodents / Atividade anti-helmíntica do acetato de carvacrila nanoencapsulado sobre nematoides gastrintestinais de ovinos e toxicidade em roedores

Abstract The objective of this study was to evaluate the efficacy of carvacryl acetate (CVA) and nanoencapsulated CVA (nCVA) on gastrointestinal nematodes of sheep. The CVA was nanoencapsulated with chitosan/gum arabic and the efficacy of nanoencapsulation (EE), yield, zeta potential, nanoparticle morphology and release kinetics at pH 3 and 8 were analyzed. Acute and subchronic toxicity were evaluated in rodents and reduction of egg counts in the faeces (FECRT) of sheep. The sheep were divided into four groups (n = 10): G1, 250 mg/kg CVA; G2, 250 mg/kg nCVA; G3, polymer matrix and G4: 2.5 mg/kg monepantel. EE and nCVA yield were 65% and 57%, respectively. The morphology of the nanoparticles was spherical, size (810.6±286.7 nm), zeta potential in pH 3.2 (+18.3 mV) and the 50% release of CVA at pHs 3 and 8 occurred at 200 and 10 h, respectively. nCVA showed LD50 of 2,609 mg/kg. CVA, nCVA and monepantel reduced the number of eggs per gram of faeces (epg) by 57.7%, 51.1% and 97.7%, respectively. The epg of sheep treated with CVA and nCVA did not differ from the negative control (P>0.05). Nanoencapsulation reduced the toxicity of CVA; however, nCVA and CVA presented similar results in the FECRT.

Resumo O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do acetato de carvacrila (ACV) e do ACV nanoencapsulado (nACV) sobre nematóides gastrintestinais de ovinos. O ACV foi nanoencapsulado com quitosana/goma arábica e foi analisada a eficácia de nanoencapsulamento (EE), o rendimento, potencial zeta, morfologia das nanopartículas e cinética de liberação em pH 3 e 8. Foram avaliadas as toxicidades aguda e subcrônica em roedores e a redução da contagem de ovos nas fezes (RCOF) de ovinos. Os ovinos foram divididos em quatro grupos (n = 10): G1, 250 mg/kg ACV; G2, 250 mg/kg de nACV; G3, matriz polimérica e G4: 2,5 mg/kg de monepantel. A EE e o rendimento de nACV foram de 65% e 57%, respectivamente. A morfologia das nanopartículas foi esférica, tamanho (810,6±286,7 nm), potencial zeta no pH 3,2 (+18,3 mV) e a liberação de 50% de CVA nos pHs 3 e 8 ocorreu às 200 e 10 h, respectivamente. nACV apresentou DL50 de 2.609 mg/kg. ACV, nACV e o monepantel reduziram a contagem de ovos por grama de fezes (opg) em 57,7%, 51,1% e 97,7%, respectivamente. A contagem de opg de ovelhas tratadas com ACV e nCVA não diferiu do controle negativo (P>0,05). O nanoencapsulamento reduziu a toxicidade do AVC; no entanto, nACV e ACV apresentaram resultados semelhantes na RCOF.

Chemical constituents of Calotropis procera latex and ultrastructural effects on Haemonchus contortus / Constituintes químicos do látex de Calotropis procera e efeitos ultraestruturais em Haemonchus contortus

Abstract This study aimed to evaluate the anthelmintic and ultrastructural effects of Calotropis procera latex on Haemonchus contortus. C. procera latex was twice centrifuged at 10,000×g and dialyzed to obtain a fraction rich in proteins, named LP (latex protein), and at 3,000 rpm to obtain a fraction rich in secondary metabolites, named LNP (latex non-protein). Specimens of H. contortus exposed to LNP, LP and PBS in the Adult Worm Motility Test (AWMT) were submitted to scanning (SEM) and transmission (TEM) electron microscopy to verify changes in their ultrastructure. Phytochemical tests in the LNP indicated the presence of phenols, steroids, alkaloids and cardenolides. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) characterized the presence of the compounds gallic acid and quercetin in the LNP. The protein content in the LP was 43.1 ± 1.1 mg/mL and 7.7 ± 0.3 mg/mL in LNP. In AWMT, LNP and LP inhibited the motility of 100% of the nematodes, with LNP being more effective than LP and ivermectin more effective than both (p <0.05). Cuticle changes were observed by SEM and TEM in nematodes treated with LP and LNP. Calotropis procera latex has anthelmintic effects against H. contortus, causing damage to its cuticle and other alterations in its ultrastructure.

Resumo Este estudo objetivou avaliar os efeitos anti-helmínticos e ultraestruturais do látex de Calotropis procera sobre Haemonchus contortus. Látex de C. procera foi centrifugado duas vezes à a 10.000xg e dialisado para obter uma fração rica em proteínas, denominada proteínas do látex (LP). E centrifugado e centrifugado a 3.000 rpm, para obter uma fração rica em metabólitos secundários, denominada LNP (látex não proteico). Espécimes de H. contortus expostos à LNP, LP e PBS no Teste de Motilidade dos Nematoides Adultos (TMNA) foram submetidos a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET), para verificar alterações em sua ultraestrutura. Testes fitoquímicos em LNP indicaram a presença de fenóis, esteroides, alcaloides e cardenolídeos. A presença dos compostos ácido gálico e quercetina em LNP foi caracterizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). O conteúdo de proteínas em LP foi de 43,1 ± 1,1 mg/mL e de 7,7 ± 0,3 mg/mL em LNP. No TMNA, LNP e LP inibiram a motilidade de 100% dos nematoides, sendo LNP mais eficaz que LP, e a ivermectina mais eficaz que ambos (p <0,05). Alterações na cutícula de nematoides tratados com LP e LNP foram observadas por MEV e MET. O látex de C. procera apresenta efeito anti-helmíntico sobre H. contortus, causando danos à sua cutícula e outras alterações em sua ultraestrutura.

Anthelmintic activity of Eucalyptus citriodora essential oil and its major component, citronellal, on sheep gastrointestinal nematodes / Atividade anti-helmíntica do óleo essencial de Eucalyptus citriodora e seu componente majoritário, citronelal, sobre nematoides gastrintestinais de ovinos

Abstract This study aimed to evaluate the anthelmintic activity of Eucalyptus citriodora essential oil and citronellal on sheep gastrointestinal nematodes. Essential oil composition was determined by gas chromatography mass spectrometry. The substances were evaluated in vitro using adult worm motility test (AWMT) and transmission electron microscopy (TEM). The acute toxicity test in mice and the fecal egg count reduction test (FECRT) in sheep were performed. Citronellal was confirmed as the essential oil major constituent (63.9%). According to the AWMT, 2 mg/mL of essential oil and citronellal completely inhibited Haemonchus contortus motility at 6 h post exposure. H. contortus exposed to essential oil and citronellal exhibited internal ultrastructural modifications. The lethal dose 50 values in mice were 5,000 and 2,609 mg/kg for essential oil and citronellal, respectively. E. citriodora essential oil reduced sheep epg at 14 days post treatment by 69.5% (P<0.05). No significant differences were observed in epg between the citronellal and negative control groups (P>0.05). The interaction between citronellal and other constituents in the essential oil may be relevant for its in vivo anthelmintic activity. Thus, E. citriodora essential oil and citronellal pharmacokinetic studies may help elucidate the anthelmintic activity of these compounds.

Resumo Este trabalho objetivou avaliar a atividade anti-helmíntica do óleo essencial de Eucalyptus citriodora e citronelal sobre nematoides gastrintestinais de ovinos. A composição do óleo essencial foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. As substâncias foram avaliadas in vitro utilizando-se teste de motilidade de vermes adultos (AWMT) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Teste de toxicidade aguda em camundongos e teste de redução da contagem de ovos fecais (FECRT) em ovinos foram realizados. Citronelal foi confirmado como componente majoritário do óleo essencial (63,9%). No AWMT, 2 mg/mL de óleo essencial e citronelal inibiram completamente a motilidade de H. contortus 6 h pós-exposição. H. contortus expostos ao óleo essencial e citronelal exibiram modificações ultraestruturais internas. Os valores da dose letal 50 em camundongos foram 5.000 e 2.609 mg/kg para óleo essencial e citronelal, respectivamente. Óleo essencial de E. citriodora reduziu opg de ovinos 14 dias pós-tratamento em 69,5% (P<0,05). Não houve diferença significativa de opg entre grupo controle negativo e citronelal (P>0,05). A interação entre citronelal e outros constituintes do óleo essencial pode ser relevante na atividade anti-helmíntica in vivo. Portanto, avaliação farmacocinética do óleo essencial de E. citriodora e citronelal pode auxiliar a elucidar a atividade anti-helmíntica desses compostos.

Potential of botanical driven essential oils against Haemonchus contortus in small ruminants / Potencial de aceites esenciales botánicos contra Haemonchus contortus en pequeños rumiantes

The livestock sector is continuously facing problems in controlling parasitic diseases especially Haemonchosis due to emergence of anthelminthic resistance and failure in vaccination control programmes. Therefore, to increase milk and meat production and emerging demand of meat free from drug residues development of new alternative approaches are appealing for prevention and control of Haemonchosis in small ruminants. Among alternatives, plants driven essentials oils have shown promising results in control of Haemonchus contortus infection at various concentrations by different assays including egg hatch assay, larval development assay, larval exsheathment assay and adult motility assay. Essential oils are complex mixtures of various impulsive or volatile compounds which have potential to control Haemonchosis. The current study reviews the therapeutic effects of essential oils of plants against Haemonchus contortus and to be used them against Haemonchus contortus for future perspectives.

El sector ganadero enfrenta continuamente problemas para controlar las enfermedades parasitarias, especialmente la hemoncosis, debido a la aparición de resistencia antihelmíntica y al fracaso en los programas de control de vacunación. Por lo tanto, para aumentar la producción de leche y carne, y la demanda emergente de carne libre de residuos de medicamentos, el desarrollo de nuevos enfoques alternativos es atractivo para la prevención y el control de la hemoncosis en pequeños rumiantes. Entre las alternativas, los aceites esenciales producidos por las plantas han mostrado resultados prometedores en el control de la infección por Haemonchus contortus a diversas concentraciones mediante diferentes ensayos, incluido el análisis de eclosión de huevos, el desarrollo de larvas, el análisis de vaciado de larvas y el ensayo de motilidad en adultos. Los aceites esenciales son mezclas complejas de varios compuestos impulsivos o volátiles que tienen potencial para controlar la hemonchosis. Este estudio revisa los efectos terapéuticos de los aceites esenciales de las plantas contra Haemonchus contortus y evalúa sus perspectivas futuras como agentes para combatir las enfermedades causadas por este parásito.

A cysteine protease from the latex of Ficus benjamina has in vitro anthelmintic activity against Haemonchus contortus / Atividade anti-helmíntica in vitro de uma protease cisteínica do látex de Ficus benjamina contra Haemonchus contortus

Abstract Haemonchus contortus is a gastrointestinal nematode that is responsible for high mortality rates in ruminant herds. The resistance of nematodes to synthetic anthelmintics is widespread and requires a continuous search for new bioactive molecules, such as proteins. The objective of this study was to evaluate the anthelmintic potential of a protease purified from the latex of Ficus benjamina against H. contortus . Fresh latex was collected from plants via small incisions in the green stems, the rubber was removed by centrifugation, and the latex protein extract (LPE) was obtained. After LPE fractionation with ammonium sulfate and chromatography of the fraction containing the highest proteolytic activity on CM-cellulose, a cysteine protease (FbP) was purified. FbP has a molecular mass of approximately 23.97 kDa, and its proteolytic activity was stable between pH 6.0 and pH 10 and over a broad temperature range, with optimum activity at 60 °C. FbP inhibited both the development and exsheathment of H. contortus larvae, with 50% effective concentrations of 0.26 and 0.79 mg/mL, respectively. We conclude that this cysteine protease from F. benjamina latex with anthelmintic activity against H. contortus could be a promising alternative for the development of products for use in parasite control programmes.

Resumo Haemonchus contortus é um nematoide gastrintestinal, responsável por altas taxas de mortalidade em rebanhos de pequenos ruminantes. A resistência dos nematoides aos anti-helmínticos sintéticos está generalizada e requer uma busca contínua por novos compostos bioativos, como as proteínas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial anti-helmíntico da protease purificada do látex de Ficus benjamina contra H. contortus . O látex fresco foi coletado das plantas por pequenas incisões nas hastes verdes e o extrato proteico de látex (EPL) foi obtido. Após o fracionamento do EPL com sulfato de amônio e cromatografia da fração contendo a maior atividade proteolítica da CM-Celulose, uma protease cisteínica (FbP) foi purificada. A FbP tem massa molecular de cerca de 23,97 kDa, a atividade proteolítica foi estável entre pH 6,0 e pH 10 e ao longo de uma ampla faixa de temperatura, com atividade ótima a 60 °C. A FbP inibiu tanto o desenvolvimento quanto o desembainhamento das larvas de H. contortus, com 50% de inibição nas concentrações de 0,26 e 0,79 mg/mL, respectivamente. Concluímos que esta protease cisteínica do látex de F. benjamina, com ação anti-helmíntica contra H. contortus, pode ser uma alternativa promissora para o desenvolvimento de produtos a serem utilizados em programas de controle de parasitos.

Anthelmintic effect of thymol and thymol acetate on sheep gastrointestinal nematodes and their toxicity in mice / Efeito anti-helmíntico do timol e acetato de timila sobre nematoides gastrintestinais de ovinos e toxicidade em camundongos

Abstract Thymol is a monoterpene and acetylation form of this compound can reduce the toxicity and enhance its biological effects. The objective of this study was to evaluate the effect of thymol and thymol acetate (TA) on egg, larva and adult Haemonchus contortus and the cuticular changes, acute toxicity in mice and the efficacy on sheep gastrointestinal nematodes. In vitro tests results were analyzed by analysis of variance (ANOVA) and followed by comparison with Tukey test or Bonferroni. The efficacy of in vivo test was calculated by the BootStreet program. In the egg hatch test (EHT), thymol (0.5 mg/mL) and TA (4 mg/mL) inhibited larval hatching by 98% and 67.1%, respectively. Thymol and TA (8 mg/mL) inhibited 100% of larval development. Thymol and TA (800 µg/mL) reduced the motility of adult worms, by 100% and 83.4%, respectively. Thymol caused cuticular changes in adult worm teguments. In the acute toxicity test, the LD50 of thymol and TA were 1,350.9 mg/kg and 4,144.4 mg/kg, respectively. Thymol and TA reduced sheep egg count per gram of faeces (epg) by 59.8% and 76.2%, respectively. In in vitro tests thymol presented better anthelmintic activity than TA. However TA was less toxic and in in vivo test efficacy was similar.

Resumo Timol é um monoterpeno e a acetilação deste composto pode reduzir a toxicidade e potencializar os seus efeitos biológicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do timol e acetato de timolila (AT) sobre ovos, larvas e adultos de Haemonchus contortus e suas alterações cuticulares, toxicidade aguda em camundongos e a eficácia sobre nematoides gastrintestinais de ovinos. Os resultados dos testes in vitro foram analisados por análise de variância (ANOVA) e comparados pelo testes de Tukey ou Bonferroni. A eficácia do teste de redução da contagem de ovos nas fezes (RCOF) foi calculada pelo programa BootStreet. No teste de inibição da eclosão de ovos (TEO), timol (0,5 mg/mL) e AT (4 mg/mL) inibiram a eclosão das larvas em 98% e 67,1%, respectivamente. Timol e AT (8 mg/mL) inibiram 100% do desenvolvimento larval. Timol e AT (800 μg/mL) reduziram a motilidade dos nematoides adultos, em 100% e 83,4%, respectivamente. O timol provocou alterações cuticulares nos nematoides adultos. No teste de toxicidade aguda, a DL50 do timol e AT foi de 1.350,9 mg/kg e 4.144,4 mg/kg, respectivamente. Timol e AT reduziram a contagem de ovos por gramas de fezes (OPG) dos ovinos em 59,8% e 76,2%, respectivamente. Nos testes in vitro timol apresentou atividade melhor anti-helmíntica do que AT. Entretanto, AT foi menos tóxico do que o timol e no teste in vivo apresentaram eficácia semelhante.

Piper aduncum against Haemonchus contortus isolates: cross resistance and the research of natural bioactive compounds / Piper aduncum contra isolados de Haemonchus contortus: resistência cruzada e a pesquisa de bioativos naturais

Abstract The anthelminthic activity of the essential oil (EO) of Piper aduncum L. was tested in vitro on eggs and larvae of resistant (Embrapa2010) and susceptible (McMaster) isolates of Haemonchus contortus. The EO was obtained by steam distillation and its components identified by chromatography. EO concentrations of 12.5 to 0.02 mg/mL were used in the egg hatch test (EHT) and concentrations of 3.12 to 0.01 mg/mL in the larval development test (LDT). Inhibition concentrations (IC) were determined by the SAS Probit procedure, and significant differences assessed by ANOVA followed by Tukey’s test. In the EHT, the IC50 for the susceptible isolate was 5.72 mg/mL. In the LDT, the IC50 and IC90 were, respectively, 0.10 mg/mL and 0.34 mg/mL for the susceptible isolate, and 0.22 mg/mL and 0.51 mg/mL for the resistant isolate. The EO (dillapiole 76.2%) was highly efficacious on phase L1. Due to the higher ICs obtained for the resistant isolate, it was raised the hypothesis that dillapiole may have a mechanism of action that resembles those of other anthelmintic compounds. We further review and discuss studies, especially those conducted in Brazil, that quantified the major constituents of P. aduncum-derived EO.

Resumo Este estudo avaliou a atividade anti-helmíntica in vitro do óleo essencial (OE) de Piper aduncum L. sobre ovos e larvas de Haemonchus contortus, verificando se um isolado resistente (Embrapa2010), apresentaria o mesmo comportamento que um sensível (McMaster). O OE foi obtido por arraste a vapor e analisado por cromatografia para identificação dos constituintes. O óleo foi avaliado nas concentrações de 12,5 a 0,02 mg/mL no Teste de eclosão dos ovos (TEO) e nas concentrações de 3,12 a 0,01 mg/mL no Teste de desenvolvimento larvar (TDL). As concentrações inibitórias (CI) foram determinadas pelo procedimento Probit do SAS e as diferenças estatísticas geradas pela ANOVA seguida pelo teste de Tukey. Para o isolado sensível obteve-se CI50 de 5,72 mg/mL no TEO. No TDL o óleo apresentou CI50 e CI90 de 0,10 mg/mL e 0,34 mg/mL para o isolado sensível e 0,22 mg/mL e 0,51 mg/mL para o resistente, respectivamente. Demonstrou-se que o OE (dilapiol 76,2%) teve alta eficácia sobre a fase L1. Devido às elevadas CIs obtidas para o isolado resistente, levantou-se a hipótese de que o dilapiol talvez possua um mecanismo de ação semelhante a algum grupo anti-helmíntico. O artigo faz uma revisão e discute estudos de quantificação dos constituintes majoritários do OE de P. aduncum, destacando os realizados no Brasil.

Anthelmintic activity of Leucaena leucocephala protein extracts on Haemonchus contortus / Atividade anti-helmíntica de extratos proteicos de Leucaena leucocephala sobre Haemonchus contortus

Abstract The objective of this study was to evaluate the effects of protein extracts obtained from the plant Leucaena leucocephala on the nematode parasite Haemonchus contortus. The seeds, shell and cotyledon of L. leucocephala were separated and their proteins extracted using a sodium phosphate buffer, and named as TE (total seed extract), SE (shell extract) and CE (cotyledon extract). Soluble protein content, protease, protease inhibitory and chitinase activity assays were performed. Exsheathment inhibition of H. contortus larvae were performed at concentrations of 0.6 mg mL–1, and egg hatch assays were conducted at protein concentrations of 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 and 0.05 mg mL–1. The effective concentration for 50% hatching inhibition (EC50) was estimated by probit. Different proportions of soluble proteins, protease and chitinase were found in TE and CE. Protease inhibitory activity was detected in all extracts. The EC50 of the CE and TE extracts were 0.48 and 0.33 mg mL–1, respectively. No ovicidal effects on H. contortus were detected in SE extracts, and none of the protein extracts demonstrated larvicidal effects on H. contortus. We therefore conclude that protein extracts of L. leucocephala had a detrimental effect on nematode eggs, which can be correlated with the high protease and chitinase activity of these extracts.

Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-helmíntica de extratos proteicos de leucena (Leucaena leucocephala) sobre Haemonchus contortus. As sementes, as cascas e os cotilédones foram moídos separadamente e as proteínas extraídas com tampão fosfato de sódio e denominados: TE (extrato total), SE (extrato casca) e CE (extrato cotilédone). O teor de proteínas, atividade proteolítica, inibitória de protease e quitinolítica dos extratos foram verificados, além da ação sobre a eclosão de ovos e desembainhamento larvar de H. contortus. A concentração efetiva para inibição de 50% da eclosão dos ovos (EC50) foi calculada através do probit. Foi demonstrado que TE e CE possuem, em diferentes proporções, proteínas solúveis, protease e quitinase. Atividade inibitória de protease foi encontrada em todos os extratos. A EC50 dos extratos CE e TE foram 0,48 e 0,33 mg de proteína mL–1, respectivamente. O extrato SE não apresentou atividade sobre a eclosão dos ovos. Os extratos proteicos não apresentaram efeito larvicida sobre H. contortus. Conclui-se que a ação de extratos proteicos de L. leucocephala afetam negativamente a eclodibilidade dos ovos, correlacionando-se com a alta atividade de protease e quitinase dos extratos testados.

Anthelmintic activity of Cymbopogon citratus against Haemonchus contortus / Atividade anti-helmíntica de Cymbopogon citratussobre Haemonchus contortus

Parasitic nematodes are of major economic importance in livestock. An alternative for the control of parasites is phytotherapy. This study evaluated the efficacy of Cymbopogon citratus decoction (CcD), C. citratus essential oil (CcEo) and citral against Haemonchus contortus using in vitro egg hatch test (EHT) and larval development test (LDT) and an in vivo test using a Meriones unguiculatus (gerbil) model. The effect of 800 mg/kg CcEo was evaluated in gerbils that had been artificially infected with 5,000 third-stage H. contortus larvae. The effective concentrations required to inhibit 50% (EC50) of egg hatching were 0.46, 0.14 and 0.13 mg/mL for CcD, CcEo and citral, respectively. The EC50 values in the LDT were 5.04, 1.92 and 1.37 mg/mL for CcD, CcEo and citral, respectively. H. contortus population in the group treated with C. citratus essential oil was reduced by 38.5% (P< 0.05) in comparison to the control group. These results suggest that it may be possible to use C. citratusessential oil to control of H. contortus parasite of small ruminant.

O parasitismo por nematoides tem grande importância econômica no rebanho. Uma alternativa para o controle de parasitas é a fitoterapia. Este estudo avaliou a eficácia do decocto de Cymbopogon citratus (DCc), do óleo essencial de C. citratus (OECc) e do citral contra Haemonchus contortus utilizando o teste in vitro de eclosão dos ovos (TEO) e o teste de desenvolvimento larval (TDL) e um teste in vivo com modelo Meriones unguiculatus (gerbil). O efeito de 800 mg/kg de OECc foi avaliado em gerbils infectados artificialmente com 5000 larvas de terceira fase de H. contortus. As concentrações efetivas necessárias para inibir 50% (CE50) da eclosão dos ovos foram 0,46; 0,14 e 0,13 mg/mL para DCc, OECc e citral, respectivamente. Os valores da CE50 no TDL foram de 5,04; 1,92 e 1,37 mg/mL para DCc, OECc e citral, respectivamente. No grupo tratado com óleo de C. citratus a população H. contortus foi reduzida em 38,5% (P < 0,05) em comparação com o grupo controle. Estes resultados sugerem que pode ser possível a utilização de óleo essencial de C. citratus para controle de H. contortus, parasita de pequenos ruminantes.

Lectin, hemolysin and protease inhibitors in seed fractions with ovicidal activity against Haemonchus contortus / Lectina, hemolisina e inibidores de protease em frações de sementes com atividade ovicida contra Haemonchus contortus

Bioactive molecules of plant species are promising alternatives for the chemical control of gastrointestinal nematodes in ruminants. Extracts of native and exotic seed species from Brazil's semi-arid region were tested in vitro in an egg hatch assay and the bioactivity of their proteins was investigated. Each seed species was subjected to three extractions with three types of solvents. All the seeds showed ovicidal activity, which varied according to the solvents. Higher ovicidal activity was found in the molecule fractions of low molecular weight (<12 kDa) for Albizia lebbeck, Ipomoea asarifolia, Jatropha curcas, Libidibia ferrea, Moringa oleifera and Ricinus communis (P<0.05, Bonferroni test). The two fractions of Crotalaria spectabilis showed the same ovicidal activity (P>0.05, Bonferroni test). Hemagglutinating activity was detected in the fractions of C. spectabilis and M. oleifera fractions, hemolysin activity in the A. lebbeck and M. oleifera fractions, serine protease inhibitory activity in the A. lebbeck, I. asarifolia, J. curcas, M. oleifera and R. communis fractions, cysteine protease inhibitor activity in the M. oleifera fraction, and no protein activity in the L. ferrea fraction. The results of this work reveal new plant species with a potential for use in controlling nematode parasites in goats, thus opening a new field of research involving plant protein molecules with ovicidal properties.

Moléculas bioativas de espécies vegetais são alternativas promissoras ao controle químico dos nematoides gastrintestinais em ruminantes. Extratos de sementes de espécies nativas e exóticas do Semiárido Brasileiro foram testados in vitro em ensaio de eclosão de ovos e investigada a natureza proteica da bioatividade. Três extrações com três solventes foram feitas para cada semente estudada. Todas as sementes apresentaram atividade ovicida, variando com o solvente utilizado. Maior taxa de inibição da eclosão concentrou-se nas frações de moléculas de baixa massa molecular (<12 kDa) para Albizia lebbeck, Ipomoea asarifolia, Jatropha curcas, Libidibia ferrea, Moringa oleifera e Ricinus communis (P<0,05, teste de Bonferroni). Crotalaria spectabilis mostrou atividade nas duas frações, sem diferença entre elas (P>0,05, teste de Bonferroni). Observou-se atividade hemaglutinante nas frações de C. spectabilis e M. oleifera, de hemolisina em A. lebbeck e M. oleifera, de atividade inibidora de protease da serina em A. lebbeck, I. asarifolia, J. curcas, M. oleifera e R. communis, de atividade inibidora de protease da cisteína em M. oleifera e nenhuma atividade proteica na fração de L. ferrea. Os resultados revelaram novas espécies botânicas com potencial de controle de nematoides em caprinos e um novo campo de pesquisa, o estudo de moléculas de origem proteica com atividade ovicida.

In vitro effects of Coriandrum sativum, Tagetes minuta, Alpinia zerumbet and Lantana camara essential oils on Haemonchus contortus / Efeitos in vitro dos óleos essenciais de Coriandrum sativum, Tagetes minuta, Alpinia zerumbet e Lantana camara sobre Haemonchus contortus

Phytotherapy can be an alternative for the control of gastrointestinal parasites of small ruminants. This study evaluated the efficacy of Alpinia zerumbet, Coriandrum sativum, Tagetes minuta and Lantana camara essential oils by two in vitro assays on Haemonchus contortus, an egg hatch test (EHT) and larval development test (LDT). No effect was observed for L. camara in the EHT. A. zerumbet, C. sativum and T. minuta essential oils exhibited a dose-dependent effect in the EHT, inhibiting 81.2, 99 and 98.1% of H. contortus larvae hatching, respectively, at a concentration of 2.5 mg mL-¹. The effective concentration to inhibit 50% (EC50) of egg hatching was 0.94, 0.63 and 0.53 mg mL-¹ for A. zerumbet, C. sativum and T. minuta essential oils, respectively. In LDT, L. camara, A. zerumbet, C. sativum and T. minuta at concentration of 10 mg mL-¹ inhibited 54.9, 94.2, 97.8 and 99.5% of H. contortus larval development, presenting EC50 values of 6.32, 3.88, 2.89 and 1.67 mg mL-¹, respectively. Based on the promising results presented in this in vitro model, it may be possible use of these essential oils to control gastrointestinal nematodes. However, their anthelmintic activity should be confirmed in vivo.

Fitoterapia pode ser uma alternativa para o controle de parasitas gastrintestinais de pequenos ruminantes. Este estudo avaliou a eficácia dos óleos essenciais de Alpinia zerumbet, Coriandrum sativum, Tagetes minuta e Lantana camara sobre Haemonchus contortus através de dois testes in vitro, teste de eclosão dos ovos (TEO) e teste de desenvolvimento larval (TDL). Nenhum efeito foi observado para L. camara no TEO. Os óleos essenciais de A. zerumbet, C. sativum e T. minuta exibiram um efeito dose dependente no TEO inibindo a eclosão das larvas de H. contortus em 81,2, 99 e 98,1%, respectivamente, na concentração de 2,5 mg mL-¹. A concentração efetiva para inibir 50% (CE50) da eclosão dos ovos foi de 0,94, 0,63 e 0,53 mg mL-¹ para os óleos essenciais de A. zerumbet, C. sativum e T. minuta, respectivamente. No TDL, 10 mg mL-¹ de L. camara, A. zerumbet, C. sativum e T. minuta inibiram em 54,9, 94,2, 97,8 e 99,5% do desenvolvimento larvar, apresentando valores de CE50 de 6,32, 3,88, 2,89 e 1,67 mg mL-¹, respectivamente. Com base nos resultados promissores apresentados neste modelo in vitro, pode ser possível a utilização destes óleos essenciais para controlar os nematoides gastrintestinais. No entanto, a sua atividade anti-helmíntica deve ser confirmada in vivo.

Frequency of benzimidazole resistance in Haemonchus contortus populations isolated from buffalo, goat and sheep herds / Frequência da resistência ao benzimidazol em populações de Haemonchus contortus isoladas de rebanhos de bubalinos, caprinos e ovinos

Anthelmintic resistance is an increasing problem that threatens livestock production worldwide. Understanding of the genetic basis of benzimidazole resistance recently allowed the development of promising molecular diagnostic tools. In this study, isolates of Haemonchus contortus obtained from goats, sheep and buffaloes raised in Brazil were screened for presence of the polymorphism Phe200Tyr in the β-tubulin 1 gene, which confers resistance to benzimidazole. The allelic frequency of the mutation conferring resistance ranged from 7% to 43%, and indicated that resistance to benzimidazole could be found in nematodes isolated from all the ruminant species surveyed. Although significant variation in the frequency of the F200Y mutation was observed between different herds or host species, no significant variation could be found in populations isolated from animals within the same herd. These findings suggest that screening of samples from a few animals has the potential to provide information about the benzimidazole resistance status of the entire herd, which would enable a considerable reduction in the costs of diagnosis for the producer. Molecular diagnosis has practical advantages, since it can guide the choice of anthelmintic drug that will be used, before its application in the herd, thus reducing the economic losses driven by anthelmintic resistance.

A resistência aos anti-helmínticos é um problema crescente que ameaça a produção pecuária em todo o mundo. A compreensão da base genética da resistência ao benzimidazol permitiu, recentemente, o desenvolvimento de métodos diagnósticos moleculares promissores. Neste estudo, isolados de Haemonchus contortus obtidos a partir de rebanhos de caprinos, ovinos e bubalinos criados no Brasil foram avaliados quanto à presença do polimorfismo F200Y no gene da β-tubulina1, o qual confere resistência ao benzimidazol. A frequência alélica da mutação variou de 7% a 43%, indicando que a resistência ao benzimidazol pode ser encontrada em nematoides isolados a partir de todas as espécies de ruminantes pesquisadas. Embora tenha sido observada variação significativa das frequências de mutação F200Y entre rebanhos/espécies hospedeiros distintos, não foi encontrada variação significativa entre populações isoladas de animais dentro de um mesmo rebanho. Estes achados sugerem que a avaliação de amostras de alguns poucos animais tem o potencial de fornecer informações sobre o nível de resistência ao benzimidazol de todo o rebanho, possibilitando uma redução considerável dos custos de diagnóstico para o produtor. O diagnóstico molecular apresenta vantagens práticas, uma vez que pode guiar a escolha da base anti-helmíntica a ser utilizada antes da sua aplicação no rebanho, reduzindo, portanto, as perdas ocasionadas pela resistência aos fármacos anti-helmínticos.

Effect of six tropical tanniferous plant extracts on larval exsheathment of Haemonchus contortus / Efeito de seis extratos de plantas taniníferas tropicais sobre o desembainhamento larvar de Haemochus contortus

Tanniferous plants represent a promising alternative for controlling gastrointestinal nematodes of small ruminants. This experiment evaluated the effects of extracts from the leaf and stem of Anadenanthera colubrina, Leucaena leucocephala and Mimosa tenuiflora on larval exsheathment of Haemonchus contortus in vitro and verified the role of tannins in this process. Third-stage larvae of H. contortus were incubated with extracts for 3 hours and were exposed to sodium hypochlorite solution. The extracts were tested at 300 µg.mL-1 and accompanied by controls: phosphate buffer solution (PBS) and polyvinyl polypyrrolidone (PVPP). The larval exsheathment was evaluated for 60 minutes, and the results were subjected to the Kruskal-Wallis test (p < 0.05). The six extracts blocked larval exsheathment. After PVPP addition, a tannin inhibitor, the exsheathment percentage was similar to the PBS (p > 0.05), except for L. leucocephala and M. tenuiflora leaf extracts. However, pre-incubation with PVPP of these two extracts significantly changed larval exsheathment when compared to the non-treated extracts (p < 0.05). These results suggest that A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora could be useful in gastrointestinal nematode control and that tannins are probably the main compounds involved in the observed effects. However, in vivo and toxicological studies should be conducted.

Plantas taniníferas representam uma promissora alternativa de controle dos nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes. Esse experimento avaliou in vitro os efeitos dos extratos das folhas e caules de Anadenanthera colubrina, Leucaena leucocephala e Mimosa tenuiflora sobre o desembainhamento larvar de Haemonchus contortus e verificou o papel dos taninos nesse processo. Larvas de terceiro estádio de H. contortus foram incubadas com 300 µg.mL-1 de extrato por 3 horas e expostas a uma solução de hipoclorito de sódio. O ensaio foi acompanhado por controles: solução salina tamponada com fosfato (PBS) e polivinilpolipirrolidona (PVPP). O desembainhamento larvar foi avaliado durante 60 minutos e os resultados submetidos ao teste Kruskal-Wallis (p < 0,05). Os seis extratos bloquearam o desembainhamento larvar. Após adição de PVPP, um inibidor de taninos, o percentual de desembainhamento foi similar ao PBS (p > 0,05), exceto nos extratos das folhas de L. leucocephala e M. tenuiflora. Entretanto, a pré-incubação desses dois extratos com PVPP alterou significativamente o desembainhamento quando comparado com extratos não-tratados (p < 0,05). Esses resultados sugerem que A. colubrina, L. leucocephala e M. tenuiflora podem ser úteis no controle de nematóides gastrintestinais e que os taninos são provavelmente os principais compostos envolvidos nos efeitos. Contudo, estudos toxicológicos e in vivo são necessários.

Atividade ovicida e larvicida in vitro do óleo essencial de Eucalyptus globulus sobre Haemonchus contortus / Ovicidal and larvicidal activity in vitro of Eucalyptus globulus essential oils on Haemonchus contortus

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do óleo essencial de Eucalyptus globulus (OEEG) sobre a eclosão e desenvolvimento de larvas de Haemonchus contortus. A determinação da composição química do OEEG foi feita por meio de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. No teste de eclosão de ovos (TEO), utilizaram-se as concentrações 21,75; 17,4; 8,7; 5,43 e 2,71 mg.mL-1; e no de desenvolvimento larvar (TDL) as concentrações foram 43,5; 21,75; 10,87; 5,43 e 2,71 mg.mL-1. Cada ensaio foi acompanhado por um controle positivo, 0,02 mg.mL-1 tiabendazol, no TEO e 0,008 mg.mL-1 ivermectina no TDL, e por um controle negativo com o diluente Tween 80 (3 por cento). A eficácia máxima obtida pelo OEEG sobre ovos foi de 99,3 por cento na concentração de 21,75 mg.mL-1 e, sobre larvas, 98,7 por cento na concentração de 43,5 mg.mL-1. A concentração do OEEG, que inviabilizou 50 por cento dos ovos e das larvas do parasito, foi de 8,3 e 6,92 mg.mL-1, respectivamente. A análise química do óleo identificou como principal componente o monoterpeno 1,8-cineol. O OEEG apresentou atividade ovicida e larvicida in vitro sobre H. contortus, determinando um bom potencial para utilização no controle de nematóides gastrintestinais de ovinos e caprinos.

The objective of this work was to evaluate ovicidal and larvicidal effects of Eucalyptus globulus essential oil (EGEO) on Haemonchus contortus. The chemical composition determination of EGEO was through gas chromatography and mass spectrometry. Egg hatch test (EHT) was performed in concentrations 21.75; 17.4; 8.7; 5.43 e 2.71 mg.mL-1. In larval development test (LDT) were used the concentrations 43.5; 21.75; 10.87; 5.43 e 2.71 mg.mL-1. Each trial was conducted by negative control with Tween 80 (3 percent) and positive control, 0.02 mg.mL -1 of thiabendazole in EHT and 0.008 mg.mL-1 of ivermectin in LDT. The maximum effectiveness of EGEO on eggs was 99.3 percent in concentration of 21.75 mg.mL-1 and on larvae was 98.7 percent in concentration 43.5 mg.mL-1. The concentration of EGEO that inhibits 50 percent of the eggs and larvae was 8.3 and 6.92 mg.mL-1, respectively. The oil chemical analysis identified as main component the monoterpen 1,8-cineol. EGEO presented ovicidal and larvicidal activities in vitro, revealing a good potential for use in the control of sheep and goat gastrointestinal nematodes.

Anthelmintic acetogenin from Annona squamosa L. Seeds

Annona squamosa seeds extracts showed anthelmintic activity against Haemonchus contortus, the main nematode of sheep and goat in Northeastern Brazil. A compound 1 was isolated from ethyl acetate extract and inhibited the egg hatching of H. contortus at 25 mg ml-1. The structure of 1 was determined as a C37 trihydroxy adjacent bistetrahydrofuran acetogenin based on spectroscopic analysis.

Extratos das sementes de Annona squamosa demonstraram atividade anti-helmíntica contra Haemonchus contortus, o principal nematódeo de ovinos e caprinos no Nordeste do Brasil. O composto 1 foi isolado do extrato acetato de etila e inibiu a eclosão dos ovos de H. contortus a 25 mg ml-1. A estrutura de 1 foi determinada como uma acetogenina C37 tri-hidroxi bis-tetrahydrofurano adjacente, baseando-se nos dados espectrais.

Diagnóstico in vitro de Haemonchus contortus resistente al albendazol, fenbendazol, oxfendazol y febantel en tres rebaños ovinos Tabasco o Pelibuey / In vitro diagnosis of resistant Haemonchus contortus to benzimidazoles in three flocks of Tabasco or Pellibuey breed sheep

El objetivo del estudio fue: a) detectar mediante una prueba in vitro, poblaciones de nematodos resistentes a bencimidazoles y prodencimidazoles en ovinos de raza Tabasco o Pelibuey y b) determinar los factores de manejo de animales y antihelmínticos que contribuyeron a la selección de los nematodos resistentes. La prueba in vitro básicamente puso en contacto huevos de H. contortus con diferentes concentraciones en ppm de tiabendazol; los resultados se sometieron a análisis Probit. El índice de resitencia alcanzado por las tres poblaciones de nematodos resistentes fue: 21.6, 17.5 y 19.2. Los factores que contribuyeron a la selección de nematodos fueron: sobrepastoreo, dosis subletales y carencia de refugio larvario. Los antihelmínticos involucrados son: albendazol, fenbendazol, oxfendazol y fabantel.

Efeito da administraçäo de oxfendazol, ivermectina e levamisol sobre os exames coproparasitológicos de ovinos / Survey of anthelmintic treatment with oxfendazole, ivermectin and levamisole in sheep flocks

O trabalho foi realizado em nove propriedades do estado de Säo Paulo, com o objetivo de verificar o efeito da administraçäo de oxfendazol, ivermectina e levamisol sobre os exames coproparasitológicos de ovinos. Em cada propriedade foram formados aleatóriamente quatro grupos de ovinos: o primeiro foi medicado com oxfendazol, na dose de 4,5 mg/kg, o segundo com levamisol, na dose de 7,5 mg/kg, o terceiro com ivermectina, na dose de 0,2 mg/kg e o quarto grupo foi o controle, näo medicado. Colheitas de fezes foram realizadas no dia da vermifugaçäo e novamente sete dias depois para a realizaçäo de exames coproparasitológicos. Após a administraçäo de oxfendazol, levamisol e ivermectina, foi verificada reduçäo estatística significativa nas contagens de ovos por grama de fezes (OPG) em duas, quatro e cinco propriedades, respectivamente, sendo Haemonchus e Trichostrongylus os parasitas com maior ocorrência no experimento. Os resultados sugerem, na maioria das propriedades, a presença de parasitas com resistência múltipla aos anti-helmínticos testados